Kristallstrukturen von Herbiziden

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4343 (2023) Diesen Artikel zitieren

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SulE, eine Esterase, die eine Vielzahl von Sulfonylharnstoff-Herbiziden durch Entesterung entgiftet, bietet einen attraktiven Ansatz zur Entfernung von Sulfonylharnstoff-Herbiziden aus der Umwelt und zur Entwicklung herbizidtoleranter Pflanzen. Hier haben wir die Kristallstrukturen von SulE und einer aktivitätsverbesserten Mutante P44R bestimmt. Die Strukturanalyse ergab, dass SulE ein Dimer mit einer geräumigen Bindungstasche ist, die das große Sulfonylharnstoffsubstrat aufnimmt. Insbesondere enthält SulE eine hervorstehende β-Haarnadel mit einer Deckelschleife, die das aktive Zentrum der anderen Untereinheit des Dimers bedeckt. Die Deckelschleife ist an der Substraterkennung und -bindung beteiligt. Die P44R-Mutation veränderte die Flexibilität der Lidschleife, was zu einer Neupositionierung des heterozyklischen Sulfonylharnstoffrings in eine relativ stabile Konformation führte, was zu einer dramatisch erhöhten Aktivität führte. Unsere Arbeit liefert wichtige Einblicke in den molekularen Mechanismus von SulE und schafft eine solide Grundlage für die weitere Verbesserung der Enzymaktivität verschiedener Sulfonylharnstoff-Herbizide durch rationales Design.

Sulfonylharnstoffe gehören weltweit zu den wichtigsten kommerziellen Herbiziden. Seit DuPont 1982 das erste Sulfonylharnstoff-Herbizid, Chlorsulfuron, synthetisierte, wurden fast 40 Sulfonylharnstoff-Herbizide entwickelt und kommerzialisiert. Die Molekülstruktur von Sulfonylharnstoffen besteht aus drei Teilen: Arylgruppe, Sulfonylharnstoffbrücke und Heterocyclus. Die am häufigsten kommerzialisierten Sulfonylharnstoff-Herbizide sind Metsulfuron-Methyl (MM), Bensulfuron-Methyl (BM), Sulfometuron-Methyl (SM), Thifensulfuron-Methyl (TM), Tribenuron-Methyl (TrM), Ethametsulfuron-Methyl (EM) und Chlorimuron -Ethyl (CE) (Abb. 1). Das Ziel des Sulfonylharnstoff-Herbizids ist die Acetohydroxysäuresynthase (AHAS, EC 2.2.1.6). AHAS ist das Schlüsselenzym für die Biosynthese der verzweigtkettigen Aminosäuren Valin, Leucin und Isoleucin in Pflanzen, Pilzen und Bakterien1. Sulfonylharnstoff-Herbizide hemmen gezielt AHAS, um die Biosynthese verzweigtkettiger Aminosäuren zu blockieren, was zur Abtötung von Unkräutern führt2. Aufgrund ihrer erheblichen herbiziden Wirkung, geringen Aufwandmengen, guten Pflanzenselektivität und relativ geringen Toxizität für Säugetiere werden Sulfonylharnstoff-Herbizide häufig zur Bekämpfung von breitblättrigen Unkräutern in verschiedenen landwirtschaftlichen Nutzpflanzen, einschließlich Mais, Sojabohnen, Weizen und Reis, eingesetzt. In den letzten Jahren betrug der weltweite Umsatz des Marktes für Sulfonylharnstoff-Herbizide mehr als 2 Milliarden US-Dollar, was mehr als 11 % des globalen Herbizidmarktes ausmacht. Darüber hinaus gilt das Sulfonylharnstoff-Herbizid als ideales Zielherbizid für die Entwicklung gentechnisch veränderter (GV) herbizidresistenter Pflanzen3,4; Daher würde ihre Nutzung weiter zunehmen.

Die sieben Herbizide sind Metsulfuron-Methyl, Ethametsulfuron-Methyl, Bensulfuron-Methyl, Sulfometuron-Methyl, Thifensulfuron-Methyl, Tribenuron-Methyl und Chlorimuron-Ethyl.

Die meisten Sulfonylharnstoff-Herbizide sind sauer (pKa = 3,3–5,2) und werden unter sauren Bedingungen leicht hydrolysiert5,6,7. In neutralen bis alkalischen Böden werden jedoch einige Sulfonylharnstoffe, darunter Chlorsulfuron, MM, SM und CE, langsam abgebaut und verbleiben über einen langen Zeitraum (mehrere Monate bis 2 Jahre)8,9. Die Rückstände dieser Herbizide im Boden wirken sich phytotoxisch auf die nachfolgenden Fruchtfolgekulturen aus10. Darüber hinaus schädigt die langfristige und umfassende Anwendung von Sulfonylharnstoff-Herbiziden nicht nur die mikrobielle Gemeinschaftsstruktur im Boden, sondern stellt auch eine Gefahr für aquatische Ökosysteme und das Grundwasser dar11,12,13. Daher haben Enzym- und Genressourcen, die den Abbau oder die Entgiftung von Sulfonylharnstoff-Herbiziden katalysieren können, einen wichtigen Anwendungswert bei der biologischen Sanierung von Sulfonylharnstoff-Herbizid-Rückständen in verschmutzter Umwelt und bei der herbizidresistenten transgenen Technik.

Der mikrobielle Abbau spielt eine wichtige Rolle bei der Entfernung von Sulfonylharnstoff-Herbizidrückständen in der Umwelt. Mikroorganismen können Sulfonylharnstoffherbizide durch Entesterung14,15, Spaltung der Harnstoffbrücke16 und Dealkylierung17 abbauen, wobei die Entesterung der wichtigste Weg ist. Zuvor haben wir ein Esterase-Gen sulE aus dem Bakterienstamm Hansschlegelia zhihuaiae S11314 geklont. SulE besteht aus 398 Aminosäuren mit einem mutmaßlichen Signalpeptid am N-Terminus. Die vorhergesagte Signalpeptid-Spaltungsstelle liegt zwischen Ala37 und Glu38. SulE katalysiert die Entesterung verschiedener Sulfonylharnstoff-Herbizide wie MM, BM, SM, TM, TrM, EM und CE zur entsprechenden herbizidinaktiven Ausgangssäure14. Daher ist SulE ein Sulfonylharnstoff-Entgiftungsenzym und kann zum Abbau von Sulfonylharnstoff-Herbizidenrückständen in der Umwelt und zum Aufbau gentechnisch veränderter Pflanzen verwendet werden, die gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide resistent sind.

Allerdings war SulE gegen TM hochwirksam, gegen andere Sulfonylharnstoffherbizide jedoch nur gering wirksam, nämlich nur 5–10 % der Wirksamkeit gegen TM14. Die geringe Aktivität gegenüber einigen persistenten Sulfonylharnstoff-Herbiziden führt normalerweise zu einer unvollständigen Entgiftung, was ihre potenzielle Anwendung stark einschränkt. Daher ist die Verbesserung der SulE-Aktivität gegen die persistenten Sulfonylharnstoff-Herbizide für die Förderung ihrer Anwendung von entscheidender Bedeutung. Kürzlich nutzten wir die gerichtete Evolution durch fehleranfällige PCR, um die SulE-Aktivität zu verbessern, und testeten erfolgreich einen Mutanten, P44R (berechnet auf der Grundlage eines reifen Enzyms, äquivalent zu P80R, berechnet auf der Grundlage von SulE in voller Länge, ergänzende Abbildung 1), was zeigte 1,7- bis 3,2-fach höhere katalytische Effizienz gegen MM, SM, CE und TrM als der Wildtyp SulE18.

Der Sequenzabgleich zeigt, dass SulE die höchste Ähnlichkeit (35 %) mit einer mutmaßlichen Esterase (BDI_1566) (PDB-Code 4Q34) aus Parabacteroides distasonis ATCC 850319 aufweist, gefolgt von Esterase 713 (31 % Sequenzähnlichkeit, PDB-Code 1QLW) aus einem Alcaligenes sp. Stamm20 und weniger als 20 % Ähnlichkeit mit anderen charakterisierten Proteinen. Darüber hinaus sind Sulfonylharnstoff-Herbizide viel größer als das Substrat dieser verwandten strukturaufgelösten Enzyme. Daher reichen bekannte Strukturen von α/β-Hydrolasen nicht aus, um den katalytischen Mechanismus und die enzymatischen Eigenschaften dieses Enzyms zu verstehen. Darüber hinaus wird uns das Verständnis der Struktur und der katalytischen Mechanismen von SulE dabei helfen, herauszufinden, warum die P44R-Mutation die Entesterungsaktivität verbesserte.

Hier berichten wir über die Kristallstrukturen von Apo-SulE, SulE im Komplex mit Chlorimuronsäure (CA, hydrolysiertes CE) und der SulE S209A/H333A-Mutante mit sieben Sulfonylharnstoff-Herbiziden. Die Strukturen zeigen, dass SulE ein Dimer mit einer Deckelschleife in einer domänengetauschten β-Haarnadel ist, die das aktive Zentrum des gegenüberliegenden Monomers abdeckt. Sieben Sulfonylharnstoffe binden auf ähnliche Weise in der geräumigen aktiven Tasche von SulE. Wir berichten auch über die Kristallstrukturen der Apo-P44R-Mutante und der P44R/S209A/H333A-Mutante im Komplex mit MM, CE und TM. Strukturvergleichsanalysen zeigen, dass die P44R-Mutation zu einer Verschiebung der Lidschleife führt, die wiederum die Substratbindung und die Enzymaktivität moduliert. Zusammengenommen bilden diese Ergebnisse die strukturelle Grundlage für den katalytischen Mechanismus der Herbizid-Entgiftungsesterase SulE und unterstreichen die wichtige Rolle der flexiblen Deckelschleife, die die Enzymaktivität durch Modulation der Substratbindung beeinflusst.

SulE wurde in E. coli BL21 (DE3) überexprimiert, gereinigt und in einer Raumgruppe P21 kristallisiert (Ergänzungstabelle 1). Die Kristallstruktur von apo-SulE wurde mit einer Auflösung von 1,46 Å durch molekularen Austausch unter Verwendung einer mutmaßlichen Esterasestruktur (35 % Sequenzidentität mit SulE, PDB-Code 4Q34) als Ausgangstemplate gelöst. Die asymmetrische Einheit enthält zwei Monomere. SulE ist ein Homodimer (Abb. 2a), was mit seinem Oligomerisierungszustand in Lösung übereinstimmt, der durch Gelfiltrationschromatographie bestimmt wurde14. Für jedes Monomer sind die Reste 12–360 anhand der Elektronendichten klar definiert. Die Gesamtstruktur des SulE-Monomers enthält eine katalytische Domäne (Reste 12–27, 55–112 und 185–360), eine Cap-Domäne (Reste 113–184) und eine hervorstehende β-Haarnadel (Reste 28–54) (Abb. 2b). ). Die katalytische Domäne ist eine typische α/β-Hydrolase-Faltung mit acht β-Strängen (β1 bis β8), sechs α-Helices (α1 bis α6) und zwei 310-Helices (η1 und η2). Die Cap-Domäne (Reste 113–184) wird in die Schleife zwischen β4 und α2 eingefügt und besteht aus zwei α-Helices (αCAP1 und αCAP2) (Abb. 2b). Insbesondere eine β-Haarnadel, die eine Lidschleife (Reste 31–51) zwischen β9 und β10 enthält, ist in jeder Untereinheit weit von der Kernregion entfernt, bedeckt aber die Cap-Domäne und liegt nahe dem aktiven Zentrum einer anderen Untereinheit im Dimer Struktur (Abb. 2). Die Dimerstruktur ist aufgrund der beiden gegeneinander gepackten Untereinheiten sehr stabil. Die PISA-Analyse (https://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html) zeigte, dass die dimere Grenzfläche für die vergrabene, lösungsmittelzugängliche Oberfläche ~33293 Å2 beträgt, was ~21 % der Fläche ausmacht gesamte lösungsmittelzugängliche Oberfläche jedes Monomers. Es gibt 65 Wasserstoffbrückenbindungen, 12 Salzbrücken und zahlreiche hydrophobe Kräfte tragen zu den Wechselwirkungen zwischen den Dimer-Grenzflächen bei.

a Gesamtstruktur des SulE-Dimers. Die Kerndomäne in Kette A wird in Cyan angezeigt. Die Cap-Domäne und die β-Haarnadel sind in Pink bzw. Gelb dargestellt. b Gesamtstruktur des SulE-Monomers aus Kette A. Sekundärstrukturelemente sind markiert.

Im Allgemeinen sind die Reste der katalytischen Triade der α/β-Hydrolase-Faltsuperfamilie Ser, His und Asp/Glu21. SulE zeigt an seinem aktiven Zentrum eine ähnliche katalytische Triade bestehend aus Ser209, His333 und Glu232. Das Nukleophil Ser209 befindet sich in einer scharfen Kurve nach dem Strang β5. Wie die mutmaßliche Esterase 4Q34 und Esterase 713 enthält SulE nicht das Konsensussequenzmotiv (Gly-X1-Ser-X2-Gly) um das nukleophile Serin. His333 befindet sich an der Schleife, die die Stränge β8 und α6 verbindet. His333 Nε2 ist in einem Abstand von 2,79 Å über eine Wasserstoffbrücke an Ser209 Oγ gebunden und für die Aktivierung des Nukleophils Ser209 verantwortlich. Der saure Rest Glu232 befindet sich am Ende des Strangs β6. Glu232 Oδ2 ist in einem Abstand von 2,64 Å stark wasserstoffgebunden an His333 Nδ1 gebunden, um den Imidazolring von His333 für die Katalyse korrekt zu positionieren (ergänzende Abbildung 2).

Wir konstruierten außerdem vier Mutanten: S209A, E232A, H333A und S209A/H333A, um die Rolle der katalytischen Triade von SulE zu verifizieren. Wie erwartet wurde durch die Mutation von Ser209, Glu232 oder His333 zu Ala die katalytische Aktivität gegenüber MM fast vollständig aufgehoben (etwa 0,001 % Aktivität blieb erhalten), und die Doppelmutation von Ser209 und His333 führte zu einem vollständigen Verlust der katalytischen Aktivität gegenüber MM (Abb. 3i), was ihre Schlüsselrolle in der Katalyse bestätigt.

a–g Die Substratbindungstasche von S209A/H333A mit MM, EM, TrM, CE, SM, TM bzw. BM. Reste (Ile43 und Tyr45), die zur Lidschleife einer anderen Untereinheit gehören, sind hellrosa dargestellt. Arg150 wird in tiefem Lachs angezeigt. Andere an der Substratbindung beteiligte Reste sind weiß dargestellt. Auch die sieben Sulfonylharnstoffe sind farblich hervorgehoben. Wasserstoffbrückenbindungen sind in schwarzen gestrichelten Linien dargestellt. Die rot gestrichelte Linie gibt die Entfernung an. h Überlagerung der sieben Substrate. i Die relative Aktivität von WT SulE und seinen Varianten zu MM. Die Daten wurden als Mittelwerte ± SD, n = 3 dargestellt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von drei Wiederholungen dar. ND nicht erkannt. Die statistische Analyse wurde mit dem zweiseitigen t-Test durchgeführt. *p = 0,0020. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um den katalytischen Mechanismus von SulE aufzuklären, haben wir die Kristallstrukturen von Wildtyp-SulE im Komplex mit CA, der Mutante S209A im Komplex mit MM und der Mutante S209A/H333A im Komplex mit MM, SM, TM, TrM, EM, BM gelöst. und CE im Bereich von 1, 29–1, 63 Å (Ergänzungstabelle 1). Die Gesamtfaltung dieser Strukturen ähnelt der der Apo-Form, mit RMSD-Werten im Bereich von 0,1–0,2 Å nach der Überlagerung aller Cα-Atome. Dies steht im Einklang mit anderen typischen α/β-Hydrolasen, da die Bindung von Substrat oder Produkt keine große Konformationsänderung induziert22.

In der S209A-MM-Komplexstruktur wurde eine deutliche Elektronendichte für den Benzolring von MM beobachtet, die Elektronendichte für die Sulfonylharnstoffbrücke und den heterocyclischen Ring war jedoch unklar, wahrscheinlich aufgrund der beträchtlichen Beweglichkeit der flexiblen Sulfonylharnstoffbrücke. Im Gegensatz dazu wurden die Sulfonylharnstoffbrücke und der heterocyclische Ring von MM deutlich beobachtet und gut im aktiven Zentrum von S209A/H333A lokalisiert, was darauf hinweist, dass MM in S209A/H333A stabiler bindet als in S209A.

In den anderen sechs substratgebundenen Komplexstrukturen von S209A/H333A konnte ebenfalls eine deutliche Elektronendichte für SM, AM, CE und TrM beobachtet werden, die Dichte für BM und TM war jedoch relativ schlecht (ergänzende Abbildung 3).

Bei der Bindung an SulE nahmen die sieben Substrate eine ähnliche Konformation mit einer Biegung an der Sulfonylgruppe an, wodurch der aromatische Ring und der Heterocyclus nahezu senkrecht zueinander standen (Abb. 3). Die Seitenkette der Reste Ala234, Phe257, Phe293, Trp296, Trp297 aus Untereinheit A und Ile43 aus Untereinheit B bildet eine tiefe hydrophobe Tasche. Der aromatische Ring ist in der Tasche eingeschlossen und wird von beiden Seiten mit Arg150 und Ala234 gefüllt. Der Heterocyclus befindet sich jedoch außerhalb der Tasche und interagiert nur mit den Resten Ile43 und Phe257. Arg150 in der Cap-Domäne und Tyr45 in der Lid-Schleife von der anderen Untereinheit des Dimers bilden einen hydrophilen Bereich der Substratbindungstasche von der anderen Seite. Die Guanidingruppe von Arg150 bildet eine starke Salzbrücke mit dem benachbarten Rest Asp151 und bildet Wasserstoffbrücken mit den Wassermolekülen in der Substratbindungstasche (ergänzende Abbildung 4). Darüber hinaus könnte das positiv geladene Arg150 das Acyl-Enzym-Zwischenprodukt stabilisieren, indem es elektrostatische Wechselwirkungen mit dem negativ geladenen Carbonylsauerstoff des Zwischenprodukts eingeht. Die hydrophile Sulfonylgruppe befindet sich in der Nähe des hydrophilen Bereichs der Tasche und bildet Wasserstoffbrücken mit einem oder beiden Arg150 und Tyr45. Darüber hinaus ist jedes Substrat von mehreren Wassermolekülen in Wasserstoffbrückenbindungsabständen umgeben (ergänzende Abbildung 5). In den sechs Strukturen von S209A/H333A, gebunden an MM, EM, TrM, CE, SM und BM, ist das Ester-O-Atom eine Wasserstoffbrücke mit den Stickstoffatomen der Hauptkette von Gly78 und Ala210 und bildet ein Oxyanionloch (Abb. 3a). -z.B). In der S209A/H333A-TM-Komplexstruktur bilden Gly78 und Ala210 jedoch Wasserstoffbrücken mit dem Sauerstoffatom der Sulfonylgruppe (Abb. 3f), während das Ester-O-Atom eine Wasserstoffbrücke mit dem Wassermolekül Wat801 bildet (Ergänzende Abb. 5f). Darüber hinaus zeigte die Überlagerung der Strukturen von apo-SulE und des S209A/H333A-TM-Komplexes, dass die Oxymethylgruppe von TM und der Imidazolring der H333-Seitenkette miteinander inkompatibel sind (ergänzende Abbildung 6), was auf die Esterbindung hinweist von TM ist an einer ungültigen Position am aktiven Zentrum der Mutante S209A/H333A gebunden. Die Überlagerung der sieben Sulfonylharnstoffkomplexstrukturen zeigte, dass die an der Bildung der aktiven Tasche beteiligten Reste fast vollständig übereinander liegen, was darauf hindeutet, dass diese Reste bei der Bindung an verschiedene Liganden keine Konformationsänderungen erfahren. Darüber hinaus ist auch der aromatische Ring dieser sieben Sulfonylharnstoffe gut übereinander angeordnet (Abb. 3h), was darauf hinweist, dass diese Einheit stark mit SulE interagiert. Allerdings sind ihre Sulfonylharnstoffbrücke und ihre heterozyklische Einheit mit Ausnahme von MM und CE (Abb. 3h) nicht gut übereinander übereinander, was darauf hindeutet, dass diese Einheit nicht fest auf SulE verankert ist.

Die SulE-CA-Komplexstruktur stellt die Bindung des Enzyms an das Produkt dar (ergänzende Abbildung 7a). Der Strukturvergleich zeigte, dass CA und CE im aktiven Zentrum gut übereinander liegen (ergänzende Abbildung 7b), was darauf hinweist, dass das Substrat und das Produkt über denselben Satz von Wechselwirkungen an SulE binden. In der Nähe von His333 wurde ein Wassermolekül Wat719 beobachtet. Wat719 bildete Wasserstoffbrückenbindungen mit His333 und dem Carboxylsauerstoffatom von CA (ergänzende Abbildung 7a), vermutlich dem deacylierenden Wassermolekül.

Um die Rolle dieser an der Substratbindung beteiligten Reste weiter zu untersuchen, wurden verschiedene Mutanten konstruiert und ihre Entesterungsaktivität gegenüber MM gemessen (Abb. 3i). Dementsprechend führte die G78A-Mutation zu einem erheblichen Aktivitätsverlust, was darauf hindeutet, dass die Aufrechterhaltung der hydrophilen Umgebung an dieser Position für die SulE-Aktivität wichtig ist. Die Reste Tyr45 und Ile43 befinden sich in der Lidschleife. Die Aktivität von I43A wurde um 55 % erhöht, was möglicherweise darauf zurückzuführen ist, dass durch diese Substitution die sterische Hinderung verringert und das Volumen der aktiven Taschen erhöht wurde. Die Aktivität von Y45A und Y45F ging um etwa 85 bzw. 98 % der Aktivität verloren. Der Grund wäre, dass die Aufhebung der Wasserstoffbindung zwischen Tyr45 und der Brücke die korrekte Positionierung des Substrats beeinträchtigt. F257A behielt etwa 33 % Aktivität, während F257W nur 18 % Aktivität behielt, wahrscheinlich weil die größere Seitenkette von Tryptophan das Substrat daran hindern könnte, in das aktive Zentrum einzudringen. Die katalytische Aktivität von SulE wurde auch beeinträchtigt, als Ala234 zu Serin und Phe293 zu Alanin mutiert wurden. Unterdessen wurde durch die Mutation von Arg150 zu Ala die katalytische Aktivität vollständig aufgehoben, was darauf hindeutet, dass Arg150 eine entscheidende Rolle bei der Erkennung und Bindung von Sulfonylharnstoffen spielt. Darüber hinaus wurden die Aktivitäten von W296A und W297A nicht bestimmt, da sie bei der Expression in E. coli BL21(DE3) unlöslich waren, was darauf hindeutet, dass diese beiden Reste für die Strukturfaltung wichtig sein könnten.

Die Strukturvergleichsanalyse wurde mithilfe einer DALI-Serversuche23 durchgeführt. SulE weist strukturelle Ähnlichkeiten mit den Esterasen auf, die zu den Familien bakterieller_Esterase, 6_AlphaBeta_hydrolase, CIB-CCG1-interacting-factor-B, Haloperoxidase, Monoglyceridelipase_lysophospholip, AlphaBeta_hydrolase und Epoxid_hydrolase gehören (Z-Scores: 17,8–41,0; Sequenzidentitäten: 12–37 %). Ergänzende Tabelle 2) von Block X in der ESTHER-Datenbank. Der Top-Strukturtreffer war eine mutmaßliche Esterase (BDI_1566) aus Parabacteroides distasonis (PDB-Code 4Q34; Z-Score = 41,0), gefolgt von Esterase 713 aus Alcaligenes (PDB-Code 1QLW; Z-Score = 37,4), die die Hydrolyse katalysiert Lotrafiban-Zwischenprodukt (2 S)−2,3,4,5-Tetrahydro-4-methyl-3-oxo-1H−1,4-benzodiazepin-2-essigsäuremethylester zu (2 S)−2,3,4 ,5-Tetrahydro-4-methyl-3-oxo-1H−1,4-benzodiazepin-2-essigsäure (IBA)20,24. SulE überlagerte sich gut mit beiden Esterasen mit einer quadratischen Mittelwertabweichung (RMSD) von 2,0 Å für die ausgerichteten Cα-Koordinaten (Abb. 4a). Die katalytischen Reste Ser, Glu und His sind vollständig konserviert (Abb. 4b).

a Strukturüberlagerung von SulE, 4Q34 und Esterase 713. Die gut überlagerte α/β-Hydrolase-Falte ist grau gefärbt. Die verschiedenen Teile sind für SulE magentafarben, für 4Q34 gelb und für Esterase 713 grün. b Überlagerung der Reste des katalytischen Zentrums von 4Q34, Esterase 713 und SulE. Die Positionen der Reste sind in der Reihenfolge 4Q34, Esterase 713 und SulE angegeben, wobei das gleiche Farbschema wie bei a verwendet wird. c Überlagerung von SulE (magenta) und Esterase 713 (grün). d Vergleich zwischen den Substratbindungstaschen von SulE (magenta) und Esterase 713 (grün). MM und IBA sind cyan bzw. gelb gefärbt.

Obwohl die Gesamtstruktur von SulE der mutmaßlichen Esterase 4Q34 und Esterase 713 ähnelt, wurden offensichtliche Unterschiede in den drei Schleifenregionen (entsprechend der Lidschleife, der Schleife 110–143 und der Schleife 240–262 in SulE) auf der Proteinoberfläche beobachtet (Abb. 4a). Die Lidschleife von SulE ist länger als die von 4Q34 und der Esterase 713. Darüber hinaus ist die Schleife 110–143 von SulE auch länger als die von 4Q34, während die Schleife 240–262 von SulE in der Esterase 713 fehlt.

Abgesehen von den Unterschieden in der Hauptkette ist der bemerkenswerte Unterschied zwischen SulE und Esterase 713 die Substratbindungstasche. Ein Vergleich der aktiven Taschen von SulE und Esterase 713 zeigte, dass sowohl SulE als auch Esterase 713 eine offene aktive Tasche haben, die für Lösungsmittel zugänglich ist (ergänzende Abbildung 8). Allerdings ist das Taschenvolumen von SulE (2210 Å3) deutlich größer als das der Esterase 713 (573 Å3). In SulE ist die Substratbindungstasche in zwei verbundene Untertaschen unterteilt, das Sulfonylharnstoffmolekül ist in einer größeren Tasche auf der einen Seite gebunden und ein Glycerinmolekül ist in einer kleineren Tasche auf der anderen Seite gebunden (ergänzende Abbildung 8a). . Bei der Esterase 713 hingegen wird die Tasche nicht erweitert, da sie durch einige Reste wie Cys71, Cys72 und Phe134 blockiert ist. Darüber hinaus fördert die von Cys71 und Cys72 am aktiven Zentrum der Esterase 713 gebildete Disulfidbindung eine engere Tasche (ergänzende Abbildung 8b).

Ein weiterer bemerkenswerter Unterschied ist neben der Taschengröße die Hydrophobie der Taschen. Bei der Überlagerung von SulE- und Esterase-713-Strukturen befinden sich MM und IBA an unterschiedlichen Positionen, obwohl beide hydrophobe Benzolringe aufweisen (Abb. 4c, d). IBA ist das Säureprodukt der Esterase 713, die Bindungsposition von IBA ist relativ zum Substrat der Esterase 71320 um 180° gedreht. Der aromatische Ring ist immer noch in der hydrophoben Tasche gefangen, die durch die Reste Cys71, Cys72, Phe134, Ala136, Ala141, Ile144 gebildet wird und Phe145, wohingegen die entsprechenden Reste in SulE überwiegend hydrophil sind. Darüber hinaus führt die Änderung der Bindungsform dazu, dass die Carbonsäure von IBA nahe an α8 liegt und eine Wasserstoffbindung mit Arg261 und Arg265 eingeht (Abb. 4d), was zu einem stabilen Protein-Ligand-Komplex führt, der verhindert, dass das weitere Substrat in den Wirkstoff eindringt Website. Daher wird die Esterase 713 durch das Produkt gehemmt20. In SulE war die Bindung von Produkt und Substrat am aktiven Zentrum jedoch ähnlich (ergänzende Abbildung 7b) und es wurde keine signifikante Produkthemmung beobachtet (ergänzende Abbildung 9). Die offensichtlichen Unterschiede in den Substratbindungstaschen hängen wahrscheinlich mit der Aufnahme bestimmter Substrate zusammen. Da die Substrate von SulE viel größer sind als die der Esterase 713, ist eine größere Substrattasche in SulE erforderlich, um die korrekte Position und Ausrichtung der Sulfonylharnstoff-Herbizide zu erleichtern.

Zuvor erhielten wir durch gerichtete Evolution einen mutierten P44R, der eine 1,7- bis 3,2-fache Verbesserung der katalytischen Effizienz gegenüber MM, SM, CE, TrM und EM zeigte, jedoch eine 0,18- bzw. 0,28-fache Abnahme der katalytischen Effizienz gegenüber BM und zeigte TM bzw.18. Strukturanalysen zeigten, dass sich Pro44 in der Lidschlaufe befindet. Um die molekulare Grundlage für die veränderte Aktivität durch die Pro44-Mutation zu verstehen, wurden die Kristallstrukturen von Apo-P44R, der Doppelmutante P44R/S209A im Komplex mit CA und der Dreifachmutante P44R/S209A/H333A im Komplex mit MM, CE und TM untersucht wurden im Bereich von 1,32–1,78 Å bestimmt (Ergänzungstabelle 1).

Die Apo-P44R-Struktur ist nahezu identisch mit der WT-Apo-SulE-Struktur mit einem RMSD von 0,17 Å des ausgerichteten Cα. Der größte Unterschied ist die Deckelschleife (ergänzende Abbildung 10a), insbesondere die Reste Ile43, Arg44 und Tyr45 mit einem RMSD von 0,18, 1,2 bzw. 0,36 Å (ergänzende Abbildung 10b). Die Elektronendichte der Seitenkette dieser drei Reste ist sehr schlecht (ergänzende Abbildung 10c). Darüber hinaus sind die B-Faktoren der Reste in dieser Schleifenregion in der P44R-Mutante viel höher als im Wildtyp, was darauf hindeutet, dass die Mutation von Pro44 zu Arginin diese Schleifenregion flexibler macht. Überlagerungsstrukturen des Apo-P44R- und P44R/S209A/H333A-MM-Komplexes (ergänzende Abbildung 11a) zeigten, dass sie nahezu identisch sind. Der einzige Unterschied ist in der Lid-Loop-Region zu beobachten: Die Bindung von MM drückte die Loop-Region vom aktiven Zentrum weg. Die bemerkte Bewegung ist der Rest Tyr45. Der Heteroring von MM besetzte die Position der Seitenkette von Tyr45 im Apo-P44R, was zu einer Bewegung der Hauptkette Cα um 3,9 Å und einer Drehung der Seitenkette von Tyr45 um etwa 90 Grad führte (ergänzende Abbildung 11a). Dies bestätigte weiter, dass die veränderte Flexibilität der Lidschleife durch die P44R-Mutation verursacht wurde. Die Konformationsänderung der Lidschleife konnte auch in der Komplexstruktur P44R/S209A/H333A-CE beobachtet werden (ergänzende Abbildung 11b). Im Gegensatz dazu induziert die Bindung von Sulfonylharnstoffen in WT SulE keine große Strukturbewegung.

Für das vollständige MM- und CE-Molekül wurde im aktiven Zentrum von P44R/S209A/H333A eine deutliche Elektronendichte beobachtet (Abb. 5a, d), was darauf hinweist, dass MM und CE in P44R/S209A/H333A fest gebunden waren. Die Überlagerung der komplexen Strukturen S209A/H333A-MM und P44R/S209A/H333A-MM (Abb. 5b, c) zeigte eine Bewegung der Deckelschlaufe aus der aktiven Tasche nach außen. Die Hauptkette der Reste 43–46 hat sich 0,9–4,8 Å vom aktiven Zentrum entfernt. Die größte Bewegung fand bei Rest 45 statt (Abb. 5c). Noch wichtiger ist, dass auch für MM eine Konformationsänderung beobachtet wurde (Abb. 5b, c). Verglichen mit dem an S209A/H333A gebundenen MM befindet sich die Phenylringeinheit von MM in einer ähnlichen Position, während die Sulfonylharnstoffbrücke und die Heterocycluseinheit eine Drehung um etwa 90° durchlaufen und der Heterocyclus die Position der Tyr45-Seitenkette im Apo einnimmt Struktur (Abb. 5b, c). Die Überlagerung der Komplexstrukturen S209A/H333A-CE und P44R/S209A/H333A-CE ergab ebenfalls eine ähnliche Konformationsänderung von CE (Abb. 5e, f). In dieser Position wurden günstigere Wechselwirkungen der Heterocyclus-Einheit von MM und CE mit P44R beobachtet. Der Heterocyclusring wurde von beiden Seiten mit Ile43 und Ser142 beaufschlagt. Darüber hinaus führt die Konformationsrotation der Sulfonylharnstoffbrücke dazu, dass das Carbonylsauerstoffatom der Brücke eine Wasserstoffbrücke mit der Aminogruppe von Arg150 eingeht (ca. 3,0 Å) (Abb. 5c, f), während in der ursprünglichen Konformation der Abstand zwischen Arg150 und dem Das Sauerstoffatom der Sulfonylgruppe von MM und CE liegt mehr als 4,0 Å (Abb. 3a, d) über dem kanonischen Wasserstoffbrückenabstand. Die Sulfonylharnstoffbrücke bildet auch Wasserstoffbrückenbindungen mit mehreren umgebenden Wassermolekülen (ergänzende Abbildung 12a, b). Diese Wechselwirkungen sorgen dafür, dass der Heterozyklus fester an das Protein bindet. Die Ergebnisse der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) zeigen auch, dass die P44R-Mutation auf SulE zu einem 1,9- bzw. 3,9-fachen Anstieg der Affinität zu MM bzw. CE führt (Abb. 6a – d).

a, d, g Die Elektronendichte von MM, CE und TM wurde am aktiven Zentrum P44R/S209A/H33A beobachtet. Die auf 1,0 σ-Niveau konturierte 2Fo_Fc-Elektronendichtekarte wird als blaues Netz dargestellt. b Überlagerung der komplexen Struktur von S209A/H333A-MM (cyan) und P44R/S209A/H333A-MM (grün). e Überlagerung der komplexen Struktur von S209A/H333A-CE (Magenta) und P44R/S209A/H333A-CE (Weiß). h Überlagerung der komplexen Struktur von S209A/H333A-TM (gelb) und P44R/S209A/H333A-TM (hellblau). c, f, i Detaillierte Analyse des aktiven Zentrums, dargestellt in den Feldern b, e, h, unter Verwendung des gleichen Farbschemas. Die Substratmoleküle MM, CE und TM sind im Stab und in der Kugel dargestellt. Interessante Reste im aktiven Zentrum werden als Stäbchen dargestellt. Wasserstoffbrückenbindungen sind in schwarzen gestrichelten Linien dargestellt.

a, b Bindung von MM an WT SulE und Variante P44R. Die injizierten MM-Konzentrationen betrugen 0,156, 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5 bzw. 10 μM. c, d Bindung von CE an WT SulE und Variante P44R. Die injizierten CE-Konzentrationen betrugen 0,78, 1,56, 3,12, 6,25 bzw. 12,5 μM. e, f Bindung von TM an WT SulE und Variante P44R. Die injizierten TM-Konzentrationen betrugen 1,25, 2,5, 5, 10 bzw. 20 μM. g, h Bindung von BM an WT SulE und Variante P44R. Die injizierten BM-Konzentrationen betrugen 0,156, 1,25, 2,5, 5, 10 bzw. 20 μM. SPR-Sensorgramme werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

In der Struktur von P44R/S209A im Komplex mit CA band jede Untereinheit ein CA-Molekül in der Substratbindungstasche; Unerwarteterweise band ein zusätzliches CE-Molekül an die Grenzfläche des Dimers und interagierte auch mit dem symmetrischen Molekül B (ergänzende Abbildung 13). Dieses CE-Molekül verursacht keine Änderung der Proteinkonformation, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise nur eine Rolle bei der Kristallpackung spielt. Eine deutliche Elektronendichte wurde auch für das vollständige CA-Molekül im aktiven Zentrum von P44R/S209A beobachtet (ergänzende Abbildung 12f). Der Strukturvergleich zeigte, dass CA und CE gut übereinander liegen (ergänzende Abbildungen 12b, c, e), was darauf hinweist, dass die Bindung des Produkts auch die Konformationsänderung in den Strukturen induziert, die die P44R-Mutation enthalten.

Interessanterweise induziert die Bindung von P44R/S209A/H333A an TM im Gegensatz zu den Komplexstrukturen P44R/S209A/H333A-MM und P44R/S209A/H333A-CE keine Konformationsänderungen in der Lidschleife (ergänzende Abbildung 11c). Die Überlagerung der Komplexe S209A/H333A-TM und P44R/S209A/H333A-TM ergab keine signifikanten strukturellen Unterschiede, und es traten auch keine Konformationsänderungen bei TM auf (Abb. 5h, i). Anders als bei der Bindung von TM im aktiven Zentrum von S209A/H333A befindet sich die Esterbindung von TM an der richtigen Position und ist im aktiven Zentrum von P44R/S209A/H333A für die Katalyse bereit. SPR-Assays zeigten, dass TM mit KD-Werten von 8,85 bzw. 7,25 μM an SulE und P44R bindet, was auf eine ähnliche Bindungsaffinität zwischen WT-TM und P44R-TM hinweist (Abb. 6e, f). Allerdings ist die Elektronendichte von TM unklar, insbesondere der Sulfonylharnstoffbrücke und der heterozyklischen Einheit (Abb. 5g), und die Gesamtelektronendichte ist schlechter als die im aktiven Zentrum von S209A/H333A beobachtete, was darauf hindeutet, dass TM in P44R instabiler gebunden war /S209A/H333A als in S209A/H333A. Trotz umfangreicher Bemühungen gelang es uns nicht, die Kristallstruktur von P44R im Komplex mit BM zu erhalten. Wir spekulieren jedoch, dass keine Konformationsänderung auftritt, wenn BM an P44R bindet, basierend auf der Tatsache, dass BM eine ähnliche Bindungsaffinität für WT und P44R aufweist (Abb. 6g, h). Der Grund für die verringerte Aktivität von P44R gegenüber TM und BM könnte daher darin liegen, dass die durch die Mutation verursachte Änderung der Flexibilität der Lidschleife nicht den Übergang von TM und BM in die stabilere Konformation induziert, wie dies bei anderen Substraten beobachtet wurde. B. MM und CE, führt jedoch stattdessen zu einer Fluktuation des Substrats im aktiven Zentrum.

Um die Auswirkung der Flexibilität der Lidschleife auf die Enzymaktivität umfassend zu analysieren, wurden sechs Reste, Gly32, Gly34, Gly49, Pro33, Pro38 und Pro41, für die Ortsmutation ausgewählt. Die Ergebnisse (Abb. 7a) zeigten, dass keine der Mutationen die Enzymaktivität verbesserte. Tatsächlich beeinträchtigten die meisten von ihnen die Enzymaktivität, insbesondere die P38G-Mutation. Dies deutet darauf hin, dass die Flexibilität bestimmter Regionen möglicherweise wichtiger ist als andere. Da die Pro44-Mutation die Enzymaktivität gegenüber den meisten Sulfonylharnstoffen dramatisch erhöhte, wurde Pro44 für die Sättigungsmutation ausgewählt. Die Ergebnisse zeigten, dass bei der Mutation von Pro44 zu den polaren Resten Arg, Asn, Gln, Lys, Ser und Thr die enzymatische Aktivität von SulE gegen MM und CE dramatisch um 28,5–487,7 % anstieg (Abb. 7b und ergänzende Abb. 14a). , B). Da sich die Schleifenregion an der Oberfläche des Proteins befindet, kann die Änderung von Pro44 zu polaren Resten dazu führen, dass die Schleife für die Einwirkung der Lösungsmittelbedingungen geeignet ist. Darüber hinaus schränkte die Anwesenheit von Pro44 auch den Prä-Prolin-Rest sterisch ein, da der Diederwinkel von Ile43 eingeschränkt war, was die Steifigkeit dieser Region der Schleife weiter verringerte25. Wenn Pro44 zu anderen Resten wie Arginin mutiert wird, verändert es nicht nur seine Flexibilität, sondern setzt auch den Prä-Prolin-Rest Ile43 frei. Unter Berücksichtigung der Starrheit und der Umgebung der Lidschleife wäre es sinnvoll, dass die Mutation von Pro44 zu hydrophilen Resten die Aktivität zu MM und CE dramatisch steigert.

a Auswirkungen von Glycin- und Prolin-Mutationen in der Lidschleife auf die Enzymaktivität. b Auswirkungen der Substitution von Pro44 durch hydrophile Aminosäuren auf die Enzymaktivität. Die relative Enzymaktivität der Varianten zu MM. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD, n = 3 dargestellt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung aus drei Wiederholungen dar. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurde ein ungepaarter zweiseitiger t-Test verwendet. *p = 0,0039 (G34A), *p = 0,016 (G49A), **p = 0,00013 (P33G), ***p = 4,8E − 06 (P38G), ***p = 1,7E − 05 (P41G) , ***p = 6,3E − 05 (P44R), ***p = 1,3E − 05 (P44N), *p = 0,0020 (P44Q), **p = 0,00036 (P44K), ***p = 3,2 E − 05 (P44S) und ***p = 2,0E − 05 (P44T). k.A. keine Bedeutung. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

SulE katalysiert die Entesterung verschiedener Sulfonylharnstoffe mit einem Methyl- oder Ethylester. Frühere Ergebnisse zeigten, dass die P44R-Mutation die katalytische Aktivität von SulE18 deutlich veränderte. Da keine strukturellen Informationen verfügbar sind, sind der katalytische Mechanismus und warum die Mutation von Pro44 zu Arginin die SulE-Aktivität verändert, derzeit noch unklar. In dieser Studie haben wir die Kristallstrukturen von SulE- und P44R-Mutanten im Komplex mit dem Substrat oder Produkt bestimmt, kombiniert mit Punktmutationen, was uns ermöglicht, den katalytischen Mechanismus und die Rolle von Strukturelementen und kritischen Resten zu verstehen, die an der Substratbindung und Katalyse beteiligt sind.

Die Struktur von SulE zeigte eine typische α/β-Hydrolase-Faltungseigenschaft. Strukturvergleiche und Punktmutanten ermöglichen uns die Annahme, dass SulE einem ähnlichen kanonischen Esterase-Katalysemechanismus folgt. Glu232, His333 und Ser209 bilden eine typische katalytische Triade; Glu232 interagiert mit His333, um die korrekte Konformation von His333 zu stabilisieren und zu positionieren, wodurch das Nukleophil Ser209 aktiviert wird (ergänzende Abbildung 2). In vielen früheren Studien führte die Mutation des Nukleophils Serin zu Alanin zu einem vollständigen Verlust der Enzymaktivität22,26. Es wurde jedoch festgestellt, dass die Mutanten SulE S209A und P44R/S209A in dieser Studie immer noch eine schwache Aktivität aufwiesen. Zuvor wurde vorgeschlagen, dass einige CC-Bindungsspaltende α/β-Hydrolasen wie BphD-Hydrolase27, MhpC-Hydrolase28 und Hydroxynitril-Lyase29 dem nichtnukleophilen katalytischen Mechanismus mit allgemeiner Base folgen, der H2O oder HCN durch das katalytische Histidin aktiviert. Später wurde die katalytische His/Asp-Dyade in einigen α/β-Hydrolasen identifiziert30,31. Der Abstand zwischen His333 und dem Substrat ist zu groß, um eine direkte Reaktion auszulösen; Daher könnte der Grund dafür, dass SulE-S209A- und P44R/S209A-Mutanten immer noch die Entesterungsaktivität behalten, darin liegen, dass ein Wassermolekül in das aktive Zentrum gelangte und direkt von His333 deprotoniert wurde, als Ser209 zu Alanin mutiert wurde, und dann als Nukleophil zum Angriff diente Esterbindung des Substrats. Dies wird dadurch gestützt, dass im aktiven Zentrum der P44R/S209A-CA-Komplexstruktur ein Wassermolekül gefunden wurde, das als Nukleophil dienen könnte (ergänzende Abbildung 15). Da die beobachtete Restaktivität bei Mutation von Ser209 zu gering ist, bevorzugen wir hier immer noch den nukleophilen Angriffsmechanismus.

Zusätzlich zur konservierten katalytischen Kerndomäne enthalten die meisten α/β-Hydrolasen im Allgemeinen eine Deckel-/Kappe-Domäne, die eine Schlüsselrolle bei der Substraterkennung, Aktivität und thermischen Stabilität spielt32. Unter den in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführten charakterisierten SulE-Homologen enthalten Streptonigrin-Methylesterase A (StnA)33, hyperthermophile Pf2001-Esterase34, stereoselektive Esterase EST35 und Carboxylesterase BCE36 alle eine Cap-Domäne, die aus vier α-Helices besteht, während die Cap-Domäne von SulE und Esterase nur 713 ist hat zwei α-Helices (Ergänzende Abbildung 16). Die Small-Cap-Domäne von SulE führt zu einer sehr offenen aktiven Tasche, die dem Lösungsmittel ausgesetzt ist (ergänzende Abbildung 8). SulE liegt in dimerer Form vor, wobei eine Deckelschleife von einer Untereinheit das aktive Zentrum der anderen Untereinheit bedeckt. Die Lidschleife enthält Ile43 und Tyr45, die für die Substratbindung und -erkennung von entscheidender Bedeutung sind, was die Bedeutung der Schleifen im aktiven Zentrum für die Proteinfunktion unterstreicht. Bemerkenswert ist, dass sich zwischen Ile43 und Tyr45 ein Prolinrest befindet, der der Lidschleife ein hohes Maß an Konformationssteifigkeit verleiht. Wir haben zuvor festgestellt, dass die P44R-Mutation die Enzymaktivität verändert und eine stärkere thermische Empfindlichkeit verursacht als der Wildtyp SulE18. Hier haben wir die Kristallstrukturen der P44R-Mutante in der Apo-Form und im Komplex mit verschiedenen Substraten bestimmt. Die Strukturanalyse zeigte, dass die Substitution von Pro44 durch Arginin die Flexibilität der Lidschleife veränderte und darüber hinaus die Verlagerung des Heterocyclusrings von MM und CE ermöglichte. Die Verlagerung des Heterocyclusrings führt zu einer stabileren Bindung des Substrats an ein Enzym und verbessert die Aktivität von SulE gegenüber MM und CE weiter. Im Gegensatz dazu war der Heterocyclusring im Wildtyp-SulE auf den Eingang der Substratbindungstasche beschränkt; Diese Position führte zu einer schwachen Wechselwirkung zwischen dem Heterocyclusring und dem Protein, wodurch die Substratbindung geschwächt wurde und Substratfluktuationen im aktiven Zentrum verursacht wurden.

Da in den Komplexstrukturen P44R/S209A/H333A-MM und P44R/S209A/H333A-CE der heterozyklische Ring die Position der ursprünglichen Tyr45-Seitenkette einnimmt, spekulieren wir, dass die sterische Hinderung von Tyr45 im Wildtyp-SulE Heterozyklen einschränkt Betreten der aktiven Tasche. Die Mutation von Tyr45 zu Ala kann das Volumen der aktiven Tasche erhöhen, hat jedoch keinen Einfluss auf die Flexibilität der Lidschleife und konnte den sterischen Hinderungseffekt nicht vollständig beseitigen. Stattdessen führt die Y45A-Mutation zum Verlust der Wasserstoffbrückenbindung zwischen Tyr45 und dem Substrat. Folglich ist die Enzymaktivität der Y45A-Mutante deutlich reduziert (Abb. 3i).

In der SulE-homologen Proteinesterase 713 (ergänzende Abbildung 17a) führte die Produkt-IBA-Bindung zu einer 3–4 Å-Bewegung der Hauptkette der Reste 36–39 der Lidschleife vom aktiven Zentrum weg 20 . Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Lidschleife auch in Esterase 713 flexibel ist. Ein weiterer Strukturvergleich der Lidschleife ergab, dass sich Lys38 und Tyr39 von Esterase 713 in derselben Position befanden wie Pro44 und Tyr45 von SulE (ergänzende Abbildung 17b). Lys und Arg haben ähnliche polare Seitenketten; Daher führt die Substitution von Pro44 durch Arg in SulE zu einer flexiblen Lidschleife (ergänzende Abbildung 11), wie sie in Esterase 713 beobachtet wird. Darüber hinaus kann auch eine Mutation von Pro44 zu einigen hydrophilen Aminosäuren, die die Aktivität von SulE erhöht, auf die Veränderung zurückzuführen sein der Flexibilität der Deckelschlaufe. Unser Befund stimmt mit einigen früheren Berichten über verschiedene Arten von Enzymen überein; Das heißt, die Modulation der Schleifenflexibilität könnte die Enzymeigenschaften verändern37,38,39.

Derzeit sind die Kristallstrukturen von Saccharomyces cerevisiae40,41, Arabidopsis thaliana42,43,44 und Candida albicans45 AHAS im Komplex mit Sulfonylharnstoff-Herbiziden aufgeklärt. Obwohl die Struktur von SulE und diesen AHASs sehr unterschiedlich ist, haben wir festgestellt, dass sie einen ähnlichen Mechanismus bei der Erkennung von Sulfonylharnstoffen haben. Beispielsweise weist MM in der Kristallstruktur von Saccharomyces cerevisiae AHAS (ScAHAS) im Komplex mit MM (PDB-Code 1T9D)41 ebenfalls eine „L“-Form auf und besetzt den Substratzugangskanal, wodurch das aktive Zentrum blockiert wird. Der Benzolring wurde hauptsächlich durch mehrere hydrophobe Reste erkannt, darunter Val191, Pro192, Ala195 und Ala200. Die Sulfonylharnstoffbrücke bildet Wasserstoffbrückenbindungen mit den Seitenketten von Lys251 und Arg380, und der heterocyclische Ring bildet eine π-π-Wechselwirkung mit Trp586 (ergänzende Abbildung 18). In der S209A-MM-Komplexstruktur ist der Benzolring auch von einigen hydrophoben Resten Ile43, Ala234, Phe257, Phe293, Trp296 und Trp297 umgeben. Die Sulfonylharnstoffbrücke bildet außerdem Wasserstoffbrückenbindungen mit zwei hydrophilen Resten Tyr45 und Arg150, und der heterocyclische Ring bildet außerdem eine π-π-Wechselwirkung mit Phe257 (Abb. 3a – g). Interessanterweise befindet sich sowohl in den Bindungstaschen von SulE als auch in ScAHAS ein Arginin, und ein Aspartat bildet an benachbarten Positionen Salz- und Wasserstoffbrücken mit ihm, um die Konformation der Argininseitenkette zu stabilisieren. Dieses Arginin ist in AHAS konserviert und spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der katalytischen Aktivität und der Bindung an Sulfonylharnstoff-Herbizide. Es wurde angenommen, dass die Mutation dieses Arginins die Resistenz von AHAS gegenüber Sulfonylharnstoffen deutlich erhöht, jedoch zum vollständigen Verlust der AHAS-Aktivität führte42. In ähnlicher Weise ist Arg150 in SulE auch ein essentieller Rest, der an der Substratbindung und -erkennung sowie der Stabilisierung des tetraedrischen Acyl-Enzym-Zwischenprodukts beteiligt ist. Die Mutation von Arg150 zu Ala führte zu einem vollständigen Verlust der SulE-Aktivität (Abb. 3i). Ähnliches Arginin findet sich auch im aktiven Zentrum anderer Hydrolasen46,47.

Zusammenfassend haben wir die Kristallstrukturen von SulE und P44R bestimmt und eine Deckelschleife als wichtiges Strukturmerkmal in SulE identifiziert und festgestellt, dass die Flexibilität der Deckelschleife nicht nur die Substratbindung beeinflusst, sondern auch die Katalyseaktivität bestimmt. Diese Studie vertiefte unser Verständnis des katalytischen Mechanismus von α/β-Hydrolasen und liefert die Grundlage für das Protein-Engineering dieser Enzyme, insbesondere derjenigen, die flexible Substrate katalysieren.

Das sulE-Gen wurde aus der genomischen DNA von H. zhihuaiae S113T amplifiziert. Das amplifizierte Fragment wurde in den Vektor pET-29a(+) ligiert, um das rekombinante Plasmid pET29a-SulE zu konstruieren. Ortsspezifische Mutationen von SulE wurden mit dem ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme) mit dem Plasmid pET29a-SulE als Matrize durchgeführt. Die Primer sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt. Alle Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

Das Wildtyp-SulE und alle Mutanten wurden in E. coli BL21 (DE3) exprimiert, wie zuvor in Lit. beschrieben. 18. Die Zellen wurden in LB-Brühe mit 50 μg/ml Kanamycin bei 37 °C gezüchtet, bis die OD600nm 0,4–0,6 erreichte, und dann wurden der Kultur 0,2 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) zugesetzt. Nach einer weiteren 12-stündigen Induktion bei 16 °C wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und durch Ultraschallbehandlung in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) aufgeschlossen. Die Zelllysate wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 15.000 × g und 4 °C geklärt, und die rekombinanten Proteine mit C-terminalem His6-Tag wurden zunächst durch eine Co2+-Chelatisierungssäule gereinigt. Die eluierten Enzymfraktionen wurden durch Gelfiltrationschromatographie auf einer Superdex 200-Säule (GE Healthcare) mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 300 mM NaCl enthielt, weiter gereinigt. Das Zielprotein wurde gesammelt und die Proteinkonzentration mit einem BCA Protein Assay Kit (Sangon Biotech Shanghai Co., Ltd.) bestimmt. Die Homogenität der Proteinfraktionen aus jedem Reinigungsschritt wurde durch SDS-PAGE überprüft.

Das gereinigte Wildtyp-SulE wurde zur Kristallisation im 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 300 mM NaCl enthielt, auf 10 mg/ml konzentriert. Die Kristallisationsbedingungen wurden in 96-Well-Platten unter Verwendung kommerzieller Kits (Hampton Research) überprüft. Für die Röntgenbeugung geeignete Kristalle wurden mithilfe der Dampfdiffusionsmethode mit sitzendem Tropfen mit einem Gesamttropfen von 2 μL (1:1 Protein:Reservoir) bei 4 °C erhalten. SulE wurde in 2–3 Tagen unter den Bedingungen von 0,1 M Zitronensäure-Trinatriumcitrat-Dihydrat (pH 5,5) und 20 % PEG 4000 kristallisiert. Die SulE-CA-Kristalle wurden durch Cokristallisation von SulE mit 5 mM CE unter den gleichen Bedingungen erhalten Wird für Apo-SulE verwendet. CE wird im Kristallisationsprozess hydrolysiert, um das Produkt CA zu ergeben. Zur Bildung von S209A-MM oder anderen Kokristallen wurden 10 mg/ml Protein mit 5 mM Substrat 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert und die Kristalle in dem Puffer gezüchtet, der 0,1 M dibasisches Ammoniumtartrat (pH 7,0) und 12 % PEG 3350. Mutant P44R wurde unter der Bedingung von 0,1 M dibasischem Ammoniumtartrat (pH 7,0) und 15 % PEG 3350 kristallisiert. Die P44R/S209A-CA-Kristalle oder andere Cokristalle wurden durch Cokristallisation von Protein mit 5 mM Substrat darunter erhalten Zustand, der für Apo-P44R verwendet wird. Aufgrund der Restaktivität von P44R/S209A wurde auch CE hydrolysiert. Vor der Datenerfassung wurden die Kristalle in einer Kristallisationslösung, ergänzt mit 20 % (v/v) Glycerin, kryogeschützt und dann in flüssigem Stickstoff blitzgekühlt.

Beugungsdaten wurden an den Strahllinien BL17U1, BL18U1 und BL19U1 der Shanghai Synchrotron Radiation Facility gesammelt. Die ursprünglichen Daten wurden mit der HKL2000-Software48 oder dem XDS-Paket49 verarbeitet. Die SulE-Struktur wurde durch molekularen Ersatz unter Verwendung des Programms PHASER50 mit den Koordinaten einer nicht charakterisierten Esterasestruktur (PDB-Code 4Q34) als Ausgangsmodell gelöst. Die Phasen für ligandengebundene SulE-Komplexstrukturen wurden ebenfalls durch molekularen Austausch unter Verwendung von apo-SulE als Suchmodell erhalten. Die Strukturverfeinerung wurde mit Phenix51 durchgeführt. Die manuelle Strukturanpassung wurde mit dem Coot-Programm52 durchgeführt. Alle Abbildungen wurden mit PyMOL (http://www.pymol.org) erstellt.

Die Esteraseaktivität von SulE und seinen Mutanten wurde gemäß der zuvor beschriebenen Methode mit einigen Modifikationen gemessen18. Kurz gesagt enthielt das allgemeine Reaktionssystem 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), jeweils 100 µM Sulfonylharnstoff-Herbizid und 0,02 µg Enzym für TM sowie 2 µg Enzym für andere Sulfonylharnstoff-Herbizide in einem Endvolumen von 1 ml. Nach 5-minütiger Inkubation bei 40 °C wurde die Reaktion durch Zugabe eines gleichen Volumens Acetonitril beendet. Die SulE-Aktivität wurde mittels HPLC-Analyse der in der gequenchten Reaktionsmischung umgewandelten Substratmenge nachgewiesen. Die HPLC-Nachweismethode wurde zuvor in Lit. beschrieben. 18. Zuerst wurde die Reaktionsprobe durch eine 0,22 μm Millipore-Membran gefiltert und dann auf einem UltiMate 3000 Titanium-System (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt, das mit einem VWD-3100-Detektor mit variabler Wellenlänge ausgestattet war. Jede Probe wurde mit einem Volumen von 20 μl auf eine C18-Umkehrphasensäule (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) injiziert. Die Säulentemperatur wurde bei 40 °C gehalten. Das mobile Phasensystem bestand aus Wasser (mit 0,5 % Essigsäure) und Acetonitril (60/40, Vol./Vol.) mit einer Flussrate von 1,0 ml/min. Die Sulfonylharnstoffe wurden bei 230 nm und 255 nm nachgewiesen. Eine Einheit Enzymaktivität wurde als die Enzymmenge definiert, die erforderlich ist, um 1,0 μmol Substrat pro Minute zu hydrolysieren.

Die Wechselwirkung von WT und mutiertem P44R mit Sulfonylharnstoffen wurde durch Oberflächenplasmonresonanz unter Verwendung des Biacore T200-Systems bei 25 °C durchgeführt. Die WT- und mutierten P44R-Proteine wurden in 10 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,5) auf 50 μg/ml verdünnt und über Aminkopplung auf den CM7-Sensorchips (GE Healthcare) immobilisiert. Die Sulfonylharnstoffe MM, CE, TM und BM wurden seriell in HEPES-Puffer (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 0,5 % Tensid P20, 3 mM EDTA, pH 7,4) verdünnt und mit einer Flussrate von 30 in die Sensorchips injiziert μl/min für 120 s, gefolgt von 300 s Pufferfluss. Der KD-Wert wurde mit der Biacore T200 Evaluation Software unter Verwendung des Steady-State-Affinitätsmodells berechnet.

Alle enzymatischen Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt, wobei ein ungepaarter zweiseitiger t-Test durchgeführt wurde. Statistische Analysen wurden mit Microsoft Excel 2016 oder GraphPad Prism 8.0 durchgeführt. Der p-Wert <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich. Die Koordinaten und Strukturfaktoren wurden in der Proteindatenbank unter den Zugangscodes 8GP0, 8GOL, 7Y0L, 8IVN, 8IW3, 8IW6, 8IVS, 8IVT, 8J7J, 8J7G, 8GOY, 7YD2, 8IVM, 8IVE und 8J7K hinterlegt. Die in dieser Studie verwendeten PDB-Codes zuvor veröffentlichter Strukturen sind 4Q34, 1QLW und 1T9D. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31970096 an JH, 42277016 an XH und 32070092 an JQ) und der Natural Science Foundation der Provinz Jiangxi (20224BAB215005 an BL) unterstützt. Wir danken den Mitarbeitern der Strahllinien BL17U1, BL18U1 und BL19U1 der National Facility for Protein Science Shanghai und der Shanghai Synchrotron Radiation Facility für ihre Unterstützung bei der Datenerfassung.

Schlüssellabor für landwirtschaftliche Umweltmikrobiologie des Landwirtschaftsministeriums, Hochschule für Biowissenschaften, Nanjing Agricultural University, Nanjing, 210095, China

Bin Liu, Weiwu Wang, Jiguo Qiu, Xing Huang, Shenshen Qiu, Yixuan Bao, Siqiong Xu, Luyao Ruan, Tingting Ran und Jian He

Hochschule für Biowissenschaften, Jiangxi Normal University, Nanchang, 330022, China

Bin Liu

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BL, TR und JH konzipierten und gestalteten das Projekt. BL, YB und SX führten die Kristallisationsexperimente durch und WW, TR und SQ sammelten kristallographische Daten und lösten die Strukturen. BL, JQ und XH trugen zur Plasmidkonstruktion, Proteinexpression und Reinigung bei. BL und LR haben alle Mutations- und Enzymtests entworfen und durchgeführt. BL führte einen SPR-Assay durch. BL, WW, TR und JH haben das Manuskript geschrieben, und alle Autoren haben die Ergebnisse analysiert und das Manuskript kommentiert.

Korrespondenz mit Tingting Ran oder Jian He.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Haigang Song und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Liu, B., Wang, W., Qiu, J. et al. Kristallstrukturen der herbizidentgiftenden Esterase zeigen eine Lidschleife, die die Substratbindung und -aktivität beeinflusst. Nat Commun 14, 4343 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40103-5

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Eingegangen: 19. Oktober 2022

Angenommen: 11. Juli 2023

Veröffentlicht: 19. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40103-5

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